Conducto nervioso conductor con propiedades piezoeléctricas para una mejor diferenciación de PC12

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12004 (2023) Citar este artículo

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La restauración del tejido nervioso sigue siendo un gran desafío, principalmente debido a la capacidad limitada de regeneración del sistema nervioso y al desarrollo de fibrosis. Esta limitación requiere el diseño de un nuevo canal de guía nerviosa para promover la reparación nerviosa. En este estudio, desarrollamos un nuevo conducto núcleo/cubierta para inducir la diferenciación de PC12. Se utilizó el método de co-electroshilado para producir una cubierta fibrosa que contiene policaprolactona/fluoruro de polivinilideno PCL/PVDF, gelatina y nanocompuesto de polianilina/grafeno (PAG). La sección central del conducto se llenó con hidrogel de gelatina y quitosano que contenía nanopartículas de PAG y ZnO. Dicho conducto muestra actividad antibacteriana, conductividad eléctrica y propiedad piezoeléctrica. El efecto de dicho conducto diseñado sobre la diferenciación de PC12 se investigó analizando los marcadores de diferenciación Nestina y la proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP2) mediante técnicas de inmunocitoquímica y PCR-RT. El resultado reveló que dicho conducto podría inducir significativamente la expresión de los genes Nestin y MAP2 en las células PC12 y, por lo tanto, es una opción viable para la diferenciación celular y la regeneración nerviosa efectiva.

Después de una lesión, el sistema nervioso tiene una capacidad intrínsecamente limitada para regenerarse1,2. El conducto de guía nerviosa (NGC) diseñado con tejido ha surgido como una alternativa esperanzadora a los injertos para reparar tejidos nerviosos dañados3,4. Para fabricar NGC con una estructura similar a la membrana extracelular (ECM), son importantes las propiedades fisicoquímicas, mecánicas y biológicas de los materiales, como la biocompatibilidad, la biodegradabilidad, las propiedades mecánicas, la mínima hinchazón e inflamación, así como la conducción nerviosa deseable4,5,6. Más allá de varias técnicas reportadas, como la impresión 3D7, la espuma con gas y la liofilización5, el electrohilado es un enfoque rentable para la producción de estructuras fibrosas y porosas que podrían imitar la ECM7,8,9 y proporcionar suficiente espacio para el crecimiento y la proliferación de células10. La policaprolactona (PCL) como polímero biocompatible con naturaleza semicristalina proporciona integridad estructural y estabilidad mecánica del andamio en ingeniería de tejidos8,11. La gelatina es un biopolímero natural ampliamente explotado en la fabricación de andamios debido a su alta biodegradabilidad, biocompatibilidad y gran adhesión celular12,13. Por lo tanto, se puede utilizar para mejorar la escasa hidrofilicidad y la ausencia de sitios de unión celular de PCL8,11. El quitosano (CS), derivado de la desacetilación de la quitina, tiene biocompatibilidad y actividad antibacteriana14,15. Considerando las características de la gelatina, la mezcla de quitosano con gelatina compensa la falta de bioactividad del quitosano16.

Numerosas investigaciones han revelado el papel eficaz de la fuerza eléctrica en la adhesión, proliferación, diferenciación y migración celular de las células nerviosas8,14. La polianilina (PANI) exhibe una alta resistencia química y térmica, así como una conductividad significativa. El grafeno con una única lámina atómica sp2 unida al carbono ha recibido más atención en la conductividad eléctrica14. Se ha demostrado que el nanocompuesto de polianilina/grafeno (PAG) tiene una conductividad mayor que PANI8,17, lo que podría ser beneficioso para el crecimiento y la diferenciación neuronal5,6,18. En la fabricación de conductos conductores se ha aplicado PAG con alta conductividad eléctrica y excelente estabilidad química. Boroojeni et al. incorporaron nanocompuesto de PAG dentro de nanofibras de gelatina para dotar al andamio de propiedades conductoras, que se asemejan al comportamiento conductor de los axones19. Mohammadi et al. declaró que el conducto PCL/gelatina conductor de nervio electrohilado multicanal que contiene 2% en peso. PAG fue el más favorable para el crecimiento celular8. Soleimani et al. afirmó que las nanopartículas de PAG podrían mejorar la adhesión y el crecimiento celular en un andamio a base de quitosano/gelatina6. Bayat et al. expresaron el papel positivo de la conductividad para la estimulación y el crecimiento celular mediante la incorporación de PAG al canal guía de alginato5.

Puede ser deseable utilizar un canal conductor neuronal autoestimulado para crear un andamio adecuado para el crecimiento y diferenciación de células de tipo neuronal20. La explotación de especies piezoeléctricas (por ejemplo, fluoruro de polivinilideno (PVDF), óxido de zinc (ZnO)) como materiales autoeléctricos bien conocidos21 con la capacidad de inducir estimulación eléctrica local es una alternativa adecuada a los estimuladores eléctricos implantables o electrodos de superficie20.poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF) han sido un punto focal de investigación debido a su piezoelectricidad relativamente intensa, termoestabilidad, buenas propiedades mecánicas, excelente biocompatibilidad y simplicidad de procesamiento22. Debido a la cadena molecular de la fase β que es responsable de las características eléctricas de este material, en la configuración plana los momentos dipolares son paralelos, lo que mejora la orientación polar bajo la fuerza de compresión externa23,24. Mohseni et al. reveló una promoción significativa del comportamiento celular en el andamio basado en gellan conductor de estímulos autoeléctricos que contiene nanofibras cortas de PVDF / MCM41 y 2% en peso. Nanopartículas PAG23. Se ha informado que el electrohilado al 20% en peso. El PVDF muestra una producción eléctrica deseable25 y la incorporación de nanoestructura de ZnO aumenta sinérgicamente las propiedades piezoeléctricas del PVDF21,25. Mientras tanto, el ZnO es un conocido agente antimicrobiano y antiinflamatorio sin efectos secundarios en las células humanas. La liberación de Zn2+ de la matriz polimérica sería beneficiosa para prevenir la inflamación inicial durante la etapa inicial de la colocación del andamio en el cuerpo26. Las células PC12 son un modelo in vitro útil para la diferenciación neuronal. Responden a varios factores de crecimiento, neurotrofinas y hormonas y pueden utilizarse para evaluar distintas respuestas durante la diferenciación27.

En este estudio, el objetivo fue investigar el efecto de las partículas nanocompuestas de PAG en la diferenciación de la línea celular PC12 y el nivel de expresión de los genes del sistema nervioso nestina y MAP2. En este sentido, se ha diseñado el canal conductor del nervio núcleo/cubierta con una estructura de nanofibras porosa rellena de hidrogel para la adhesión y diferenciación celular. La cubierta estaba hecha de PCL/PVDF coelectroshilado junto con fibras de gelatina que contenían nanopartículas de PAG y enrolladas en forma de canales. La sección central del conducto se llenó con hidrogeles de quitosano/gelatina que contenían nanopartículas de ZnO y nanopartículas de PAG. Una muestra sin PAG y una muestra que contiene 2 wt. El % de PAG en las secciones del núcleo y la cubierta se fabricó y analizó con diversas técnicas. Finalmente, se estudió la capacidad de los conductos fabricados para diferenciar células PC12 mediante PCR en tiempo real e inmunocitoquímica.

Gránulos de PCL (Mn = 80 000 g mol-1), gelatina (polvo de piel porcina tipo A), fluoruro de polivinilideno (PVDF; Mn = 270 000 g mol-1), monómero de anilina, quitosano (Cs; desacetilación 75-85%), amonio peroxidisulfato (APS), grafeno, dodecilsulfato de sodio (SDS), suero fetal bovino (FBS), solución salina tamponada con fosfato (PBS), penicilina-estreptomicina y tripsina-EDTA, caldo neutralizante dey-engley (DE), 4′,6 -Dihidrocloruro de diamidino-2-fenilindol (DAPI), todos se obtuvieron de Sigma-Aldrich. La N, N-dimetilformamida (DMF), el ácido clorhídrico (HCl), el ácido acético glacial, el agar triptón de soja (TSA), el paraformaldehído, la albúmina sérica bovina (BSA), el etanol, el metanol y la acetona se adquirieron de Merck (Alemania). La solución de glutaraldehído (GTA; 50%) fue suministrada por Beijing Chemical Reagents. El DMEM/F12 modificado de Dulbecco se obtuvo de Gibco Invitrogen. SYBER Green Master Mix (Pluse 2x, High ROX™, Dinamarca), ZnO con una pureza superior al 99,5 % se adquirió de Bonyan Shimi Company, Teherán, Irán. Los anticuerpos (MAP2, Nestin) y las células PC12 se obtuvieron del Instituto Pasteur, Teherán, Irán.

La síntesis de polianilina/grafeno (PAG) se realizó según la Ref.8,17. Para hacer esto, se preparó una mezcla de 5 g de grafeno en 100 ml de HCl (1 M) que contenía monómero de anilina mediante dispersión ultrasónica durante 10 minutos para obtener una mezcla espumosa. Luego se añadieron al recipiente 5,767 g de SDS en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente, seguido de la adición de 0,913 g de APS y se continuó la agitación durante 6 h hasta que el color cambió de lechoso a azulado. Después de eso, se añadió metanol a la mezcla para detener la reacción. A continuación, se repitió el paso de lavado tres veces con etanol, metanol y agua destilada. Finalmente, la PAG sintetizada se secó en una estufa a 50 °C durante 48 h.

Se obtuvo una solución de PCL al 13 % p/v en acetona (0,65 g en 5 ml) con un agitador magnético a 50 °C durante 2 h. Mientras tanto, se disolvieron 0,95 g de PVDF (19% p/v) en 5 ml de DMF mediante un agitador magnético a temperatura ambiente durante 1 h. La solución de PCL-PVDF se preparó mezclando las soluciones de PCL y PVDF (proporción de acetona a DMF ~ 50:50). ) y la mezcla se agitó durante 2 h. También se preparó una solución de gelatina al 32% p/v (1,6 g en 5 ml) en ácido acético:agua (60:40). El 2 peso disperso. Se añadió % de nanocompuesto de PAG en agua destilada a la solución de gelatina y el proceso de mezcla se continuó durante 20 min.

El proceso de co-electrospinning se llevó a cabo con 5 ml de cada solución utilizando una aguja calibre 22 durante 8 h. Los parámetros de electrohilado para cada solución fueron los siguientes: Jeringa 1 que contenía solución de PCL/PVDF con un caudal de 0,5 ml/h, voltaje aplicado de 13 kV y distancia entre la punta y el colector de 15 cm; y la jeringa 2 que contiene nanopartículas de gelatina/PAG, el caudal de 0,2 ml/h, el voltaje aplicado de 10 kV y la distancia entre la punta y el colector de 16 cm. Se electrohilaron y secaron dos esteras con y sin nanopartículas de PAG en un horno de vacío.

Se disolvió 1% p/v de quitosano en ácido acético, seguido de 1 h de incubación a 50 °C. Simultáneamente se disolvió la gelatina en agua destilada durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, se mezclaron la solución de gelatina y la solución de quitosano mediante agitación magnética durante 30 min. Luego, se dispersaron nanopartículas de ZnO al 1% p/v en agua destilada mediante ultrasonicación durante 2 minutos y se agregaron a la solución de quitosano-gelatina. El 2 peso disperso. Se vertió % de nanocompuesto de PAG en agua destilada sobre la solución de quitosano y gelatina. Finalmente, los hidrogeles con y sin nanopartículas de PAG al 2% p/v se colocaron en el liofilizador durante 24 h.

Se enrollaron piezas rectangulares de andamios de nanofibras electrohiladas sin y con 2% en peso de nanopartículas de PAG alrededor de un tubo de teflón y se les dio forma de canal y se denominaron PAG0 y PAG2, respectivamente. Los conductos se colocaron en la cámara de vapor GTA (25 G v/v) durante 48 h. Después de eso, el extremo de los conductos se cerró con papel de aluminio. El conducto PAG0 se llenó con un hidrogel que contenía Cs/gelatina/1% en peso de ZnO y se denominó PCN0, mientras que el conducto PAG2 se llenó con un hidrogel que contenía Cs/gelatina/1% en peso de ZnO/2% en peso de PAG y fue denominado PCN2. A continuación, también se cubrió la parte superior de ambos conductos y los conductos se colocaron en un liofilizador durante 24 h (Alemania, CHRIST Alfa 1–2 LDplus). La imagen fotométrica del conducto con estructura núcleo-carcasa, así como su forma y tamaño, se representa en la Fig. 1.

La imagen fotométrica del conducto (a), la estructura núcleo-cubierta con su tamaño (b).

La evaluación de las características texturales, la microestructura del conducto, la morfología celular y la unión se realizó mediante el método de imágenes SEM utilizando el aparato TESCAN (Mria3, República Checa). Los grupos funcionales se evaluaron mediante FTIR (Bruker, Ettlingen, Alemania) dentro del rango de 4000– 500cm-1. La humectabilidad del andamio electrohilado se evaluó utilizando un medidor de ángulo de contacto (DSA25E, Kruss GmbH, Alemania).

No se utilizaron humanos ni animales en este estudio.

Para determinar la tasa de degradación del conducto in vitro, cada muestra se sumergió en una placa de 24 pocillos que contenía PBS durante 21 días. Luego, la placa se colocó en una incubadora con agitación con rotación de 60 rpm a 37 °C. Finalmente, se utilizó un papel de filtro para eliminar el agua restante y se calculó la degradación in vitro mediante la Ec. (1).

donde Wd y Wf fueron el peso del corte transversal de los conductos antes y después de flotar en PBS, respectivamente8.

Para evaluar la propiedad piezoeléctrica del conducto nervioso, se utilizó un brazo móvil mecánico. El voltaje de salida se registró aplicando fuerza mecánica a la muestra y produciendo un campo eléctrico. El instrumento aplica una carga mecánica de aproximadamente (1 ± 1 N) sobre 1 cm2 de superficie de la muestra a una frecuencia constante de 1 Hz. Se colocaron dos láminas de aluminio sobre la muestra y se midió la conductividad eléctrica con un osciloscopio.

La conductividad eléctrica de las muestras se midió con dos láminas de aluminio unidas a ambos lados de cada muestra mediante un osciloscopio, donde la tasa de corriente (I) equivalía a 0,6 mA en la ecuación. (2).

donde σ, I, V y t representan conductividad eléctrica (S/cm), corriente (A), voltaje (V) y espesor (cm), respectivamente8,14. Los experimentos se realizaron por triplicado.

Para la esterilización, los conductos se cortaron transversalmente y se sumergieron en etanol al 70% durante 60 min. Después de retirar el andamio del etanol, los andamios se sometieron a 15 minutos de lavado con PBS tres veces. Ambos lados de los conductos fueron esterilizados con radiación ultravioleta durante 20 min. Para investigar la capacidad de adhesión, se recolectaron células PC12 en medio Eagle modificado de Dulbecco/mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F12, GIBCO Invitrogen) suplementado con 10% de FBS y 1% de antibiótico (penicilina-estreptomicina) y se monitorearon durante 7 días. Para realizar el análisis FESEM, cuando la confluencia celular alcanzó el 80 %, las células se sembraron a una densidad de 1 \(\times 10\)4 células/conducto y se fijaron con glutaraldehído al 2,5% durante 24 h. Cada tipo de conducto se deshidrató con concentraciones graduadas de etanol (50, 60, 70, 80, 90 y 100 % v/v) durante 5 minutos y luego se secó bajo una campana extractora28.

La actividad antibacteriana de los PAG0 y PAG2 fabricados se expresó mediante el estándar medio McFarland29. Este método se basa en la unidad de recuento de colonias (UFC), tanto contra Escherichia coli PTCC1399 (E. Coli) como contra Staphylococcus aureus PTCC1112 (S. aureus) y como bacteria Gram negativa y Gram positiva. Por lo tanto, se preparó una suspensión media McFarland a partir de bacterias. Los andamios nanofibrosos PAG0 y PAG2 se cortaron a 7 × 7 mm y se les añadió un agar líquido, seguido de una incubación a 37 ° C durante 24 h. En el tiempo de contacto previsto, se añadió neutralizador DE a cada muestra en una dilución de 1:10 y la muestra se sonicó durante 1 min. Luego, la suspensión se cultivó en medio TSA y las placas se incubaron durante 34 h. Al final se contó el número de colonias bacterianas viables. Se utilizó la siguiente ecuación para evaluar la actividad antibacteriana.

donde CFUcontrol y CFUsample son el número promedio de bacterias en PAG0 y PAG2, respectivamente.

La extracción de ARN total de células PC12 se realizó utilizando un kit de aislamiento de ARN (Taiwán, Favorgen, mini kit de extracción de ARN total). Se utilizó un kit de síntesis de ADNc (Thermo Scientific, EE. UU.) para convertir el ARN total en ADNc. Las reacciones de PCR en tiempo real se realizaron utilizando SYBR Green Master Mix (Amplicon RealQ Plus 2x, High ROX™, Dinamarca). Para la PCR en tiempo real, todas las reacciones se realizaron en condiciones idénticas, incluidos 40 ciclos de amplificación con desnaturalización a 95 °C. durante 30 s, recocido a 60 °C durante 20 s y alargamiento de 30 s a 72 °C durante 40 ciclos. Se utilizaron análisis de curvas de fusión y electroforesis en gel para determinar la especificidad de cada conjunto de cebadores. La expresión de los genes diana (nestina y proteína 2 asociada a microtúbulos (MAP2)) se calculó después de la normalización con el gen de mantenimiento de β-actina y el método 2-∆∆CT28. Las secuencias de cebadores específicas para cada gen se resumen en la Tabla 1.

Los conductos sembrados con PC12 se analizaron después de 21 días de incubación para expresar los marcadores de proteína nestina y Map2 a través de ICC. Los conductos se lavaron con PBS y se fijaron con paraformaldehído %4 a 4ºC con incubación de paraformaldehído para expresar dos veces con PBS. Las células inmovilizadas se sumergieron en suero de cabra durante 45 min. Luego se sumergieron en solución Triton (4%) durante 5 min. Los anticuerpos primarios de nestina y MAP2 (Pasture Institute, Teherán, Irán) se incubaron durante la noche a 4 ° C y se lavaron dos veces con PBS. Finalmente, se añadió 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Sigma-Aldrich) para marcar los núcleos celulares y se incubó durante 30 s. Se lavaron dos veces con PBS. Se utilizó microscopía de fluorescencia (FV500, Olympus Fluoview, Japón) para obtener imágenes de inmunofluorescencia30,31.

Todos los datos fueron analizados por GraphPad Prism versión 9.0.0, con la prueba ANOVA unidireccional. Los datos se expresaron como la media ± desviación estándar (DE) de tres experimentos. Los valores de p inferiores a 0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Para determinar la morfología de la superficie del conducto propuesto, utilizamos la técnica de imágenes SEM. La micrografía de PAG0 y PAG2 se muestra en la Fig. 2a, b. Como se puede observar, las fibras preparadas tenían una estructura lisa y uniforme sin ningún rastro de perlas. El panel derecho de la Fig. 1a, b muestra el diámetro promedio de las nanofibras, según el cual, el diámetro promedio de PAG0 y PAG2 fue 420 ± 112 nm y 198 ± 91 nm, respectivamente.

Micrografías FESEM y el diámetro medio de las fibras de la capa nanofibrosa PAG0 (a), PAG2 (b). Espectros FTIR de esteras fibrosas PAG0 y PAG2 (cubierta de conductos) (c); el ángulo de contacto promedio de PAG2 (carcasa del conducto) (d); Micrografías FESEM del hidrogel CS-GEL/ZnO (1%)/PAG (2%) (e).

Los espectros FTIR de la carcasa de los conductos (PAG0 y PAG2) se muestran en la Fig. 2c. El pico a 3400 cm-1 se atribuyó al estiramiento N – H. Las bandas en el rango de 1500-1600 cm-1 se relacionaron con el estiramiento de C-N de los bencenos y quinónicos debido a la presencia de nanocompuesto PAG en la cubierta del conducto PAG24. Los picos de PCL se observaron a 1240 cm-1 (estiramiento asimétrico de C-O-C) y a 2932 cm-1 (estiramiento asimétrico de CH2). Se encontró que las bandas de gelatina estaban a 3400 cm-1, 1540 cm-1 y 1240 cm-1 y se asignaron al estiramiento N – H, estiramiento C – N y N – H, respectivamente. Las bandas relacionadas con el β-PVDF también se detectaron a 879 cm-1 y 1237 cm-132,33 en ambos conductos (PAG0 y PAG2). El ángulo de contacto del conducto que contenía 2% en peso de PAG fue de alrededor de 55 ° ± 1 °, que es menos de 90 °, lo que confirma la característica hidrófila del conducto fabricado, como se muestra en la Fig. 2d.

En la Fig. 2e se muestran imágenes SEM del hidrogel CS / gelatina que contiene PAG y ZnO.

La Figura 3 representa la tasa de degradación in vitro de conductos fabricados. Es evidente que existe una diferencia significativa entre la tasa de biodegradación de PCN0 y PCN2. La menor tasa de degradación de PCN2 que la de PCN0 podría atribuirse a la presencia de nanocompuestos de PAG en las secciones del núcleo y la cubierta de PCN2.

Degradación del conducto sin y con 2% en peso de nanopartículas de PAG (PCN0, PCN2) después de 3, 7 y 21 días. Los resultados obtenidos se presentan como la media ± DE de al menos tres réplicas. *p<0,05, ***p<0,001.

Muchas investigaciones sugirieron que los estímulos eléctricos desempeñan un papel crucial en el control de funciones celulares como la proliferación, diferenciación y migración5,11. El uso de materiales piezoeléctricos brinda una buena oportunidad para inducir estimulación eléctrica localizada dentro del cuerpo de forma no invasiva34.

Las propiedades piezoeléctricas y la conductividad eléctrica de los conductos PCN0 y PCN2 se informan en la Fig. 4 y la Tabla 2, respectivamente. Se encontró que el voltaje de salida era 400,3 ± 99 para PCN0 y 1000,3 ± 100 para PCN2. Además, existe una diferencia significativa entre la conductividad eléctrica de PCN0 y PCN2. La incorporación de un nanocompuesto de PAG al 2% en el conducto produce un aumento significativo en el voltaje de salida y la conductividad eléctrica.

El efecto del nanocompuesto PAG en el voltaje de salida del conducto (PCN0 vs. PCN2).

La morfología celular y la unión de PC12 sembradas en los conductos PCN0 y PCN2 fabricados se estudiaron utilizando imágenes SEM después de 21 días. En ambas muestras se observa una unión adecuada de las células (Fig. 5). Sin embargo, la propagación celular en la superficie del conducto es más pronunciada para PCN2 que para PCN0. Las células forman largas ramas citoplasmáticas e interactúan con las paredes de los poros a través de las nanofibras de las estructuras. Se ha afirmado que las células exhiben formas alargadas en ambientes deseables, lo que podría ser un signo de biocompatibilidad de superficies específicas hacia la unión celular35. Parece que la presencia de un 2% en peso de nanocompuesto de PAG en el canal de guía neuronal contribuyó significativamente al crecimiento y la adhesión de las células PC12.

Micrografías FESEM de la adhesión y proliferación de células PC12 en los conductos PCN0 (a) y PCN2 (b).

El efecto del nanocompuesto de PAG sobre la propiedad antibacteriana del andamio fibroso se investigó utilizando el método CFU contra ambas cepas de bacterias Staphylococcus aureus y E. coli como se muestra en la Fig. 6. Los resultados obtenidos muestran que PAG2 inhibe el crecimiento en un 25% y un 51% en Cepas de bacterias Staphylococcus aureus y E. coli, comparadas con PAG0. Los materiales a base de grafeno pueden interactuar con las células bacterianas e impedir su crecimiento debido a su pequeño tamaño, grupos funcionales, presencia de electrones libres y bordes afilados de las nanohojas de grafeno11. Es evidente que dicho conducto tiene propiedades antibacterianas que serían beneficiosas para su uso en ingeniería de tejidos.

Prueba antibacteriana de andamios nanofibrosos PAG0 y PAG2 sin y con nanocompuesto de PAG al 2% en la estructura de la cubierta.

Para investigar el efecto del nanocompuesto de PAG en la diferenciación celular, se analizaron genes relacionados con la diferenciación neuronal mediante análisis cuantitativo por PCR en tiempo real y se realizó inmunocitoquímica (tinción DAPI). La Figura 7 representa la expresión de los genes Nestin y MAP2 bajo el efecto de los conductos PCN0 y PCN2. Los resultados de la expresión del gen Nestin en las células adheridas a ambos conductos fueron significativamente superiores a los de las células control (p < 0,001). También se descubrió que la expresión del gen MAP2 era notablemente mayor cuando las células se adherían a PCN2 que a PCN0. Sin embargo, el efecto de PCN2 sobre la expresión del gen MAP2 fue más significativo (p <0,001).

Expresión del gen Nestina en las células PC12 diferenciadas en el canal de conducción neural PCN0 y PCN2 (a); Expresión del gen MAP2 en las células PC12 diferenciadas en el canal de conducción neural PCN0 y PCN2 (b). Los resultados obtenidos se presentan como la media ± DE de al menos tres réplicas. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

El resultado de la tinción DAPI se muestra en la Fig. 8. Se descubrió que PCN2 puede inducir eficientemente niveles más altos de proteínas neurogénicas Nestin y MAP2 en comparación con PCN0. Además, la colocalización de DAPI mostró que PCN2 tenía una velocidad de reacción más alta en comparación con PCN0. Esto podría atribuirse a la presencia de 2% en peso de PAG en las secciones de núcleo y cubierta del conducto, lo que promueve las propiedades eléctricas y piezoeléctricas del compuesto.

Micrografías de inmunotinción de células PC12 cultivadas en el conducto PCN0 (canal de guía neuronal sin nanocompuesto de PAG) y el conducto PCN2 (canal de guía neuronal que contiene 2% en peso de nanocompuesto de PAG en la estructura del núcleo y la cubierta).

Los nervios dañados en el sistema nervioso tienen una capacidad limitada de regeneración espontánea1,2. Esto a menudo conduce a discapacidades permanentes y, por lo tanto, es importante regenerar los nervios lesionados para recuperar la función del sistema nervioso. La débil capacidad de regeneración intrínseca del sistema nervioso implica el establecimiento de un enfoque novedoso que pueda inducir la reparación y regeneración de los nervios. La ingeniería de tejidos ha proporcionado métodos basados en células para reducir las limitaciones terapéuticas36. Intentar fabricar un andamio biodegradable y biocompatible con una porosidad deseable a partir de polímeros naturales y sintéticos para el crecimiento, la proliferación y la diferenciación de las células es muy prometedor. La NGC proporciona una herramienta estable y alargada con una estructura similar a la ECM para apoyar el crecimiento de los axones con el fin de establecer conexiones sinápticas37. Este estudio se propuso investigar el efecto de los nanocompuestos de PAG en la diferenciación de PC12 y la consiguiente renovación nerviosa. En este sentido, sintetizamos una nueva estructura núcleo/capa que mostró propiedades intrigantes como conducto nervioso. PCL, PVDF, gelatina y PAG fueron los componentes principales de la cubierta fibrosa del canal. Mientras tanto, el quitosano y la gelatina formaron el hidrogel y se incorporaron con nanopartículas de PAG y ZnO como una sección central del conducto. El PCL es biocompatible y biodegradable y proporciona integridad y propiedades mecánicas de la cubierta8,30. Sin embargo, sus pobres propiedades biológicas e hidrofobicidad pueden compensarse utilizando un polímero natural como la gelatina8. El quitosano (Cs) es una sustancia natural, biocompatible y biodegradable con propiedades antibacterianas14,16. Sin embargo, la bioactividad del CS es débil y, por lo tanto, se mezclan materiales biológicamente activos como la gelatina8. El PVDF, como plataforma orgánica piezoeléctrica bien conocida, es liviano, biocompatible, flexible y electroactivo38. ZnO es un material piezoeléctrico con la capacidad de generar electricidad en respuesta a estimulación mecánica externa. Además, tiene una amplia aplicación en el ámbito biomédico debido a sus propiedades ecológicas, no tóxicas, antibacterianas y proangiogénicas21. El uso de PVDF en la cubierta fibrosa y la adición de nanopartículas de ZnO al hidrogel proporciona propiedades piezoeléctricas en la cubierta y la estructura central del conducto. Muchos investigadores han demostrado que la conductividad eléctrica de PAG tiene un efecto significativo sobre la adhesión, el crecimiento, la migración y la diferenciación de las células nerviosas6,23.

Las imágenes SEM mostraron que la incorporación de PAG redujo el diámetro de las fibras. Esto puede ser el resultado de una mayor conductividad eléctrica. La presencia de nanocompuestos PAG también podría afectar positivamente a la preparación de fibras electrohiladas lisas. Además, la adición de PAG podría reducir la biodegradabilidad del conducto. Más exactamente, los nanocompuestos de PAG fueron capaces de prevenir la degradación prematura del conducto, lo que puede mejorar eficazmente el crecimiento celular y la supervivencia en el conducto8. La prueba antibacteriana reveló que el conducto fabricado tenía la potencia de reducir la colonia de bacterias S. aureus y E. coli. Se reveló que el PCN2 tiene una conductividad eléctrica prometedora, así como una propiedad piezoeléctrica, lo que mejora la función de guía nerviosa del conducto. El resultado más interesante de este estudio fue el aumento de los niveles de genes y proteínas de marcadores específicos relacionados con los nervios, como Nestin y MAP2, bajo el efecto del nanocompuesto PAG. La expresión activa de Nestin y MAP2 durante el proceso de diferenciación neuronal se ha informado en estudios previos39,40,41. Nestina, que es el nombre común de la proteína de las células madre neuroepiteliales, es un filamento intermedio que se considera altamente relacionado con funciones fundamentales de las células madre, incluida la autorrenovación, diferenciación, proliferación y migración39. En particular, la expresión del gen Nestin es transitoria y se provoca principalmente durante el desarrollo del tejido o condiciones patológicas para mejorar la regeneración del tejido42. MAP2 está abundantemente localizado en el cuerpo celular y las dendritas de las neuronas y tiene importantes contribuciones en el crecimiento neuronal y la plasticidad sináptica43. Una parte importante del proceso de neurogénesis es el ensamblaje de microtúbulos, en el que MAP2 desempeña un papel fundamental en la formación de neuritas, que pueden convertirse en dendritas y axones42. Se ha encontrado MAP2 en la célula neural madura, lo que es indicativo de una baja expresión del gen MAP2 durante las primeras etapas de diferenciación42. Por lo tanto, el aumento de la expresión y el nivel de proteína de MAP2, que se observó en este estudio, muestra que el nanocompuesto PAG2 fue capaz de promover la diferenciación neuronal y la maduración del conducto. Es interesante observar que el nivel de expresión génica tanto de Nestin como de MAP2, como marcadores bien conocidos de diferenciación neuronal, se regula significativamente a la baja después del proceso de diferenciación y maduración neuronal42. Esto significa que estos genes se activan en presencia de un estímulo de diferenciación y en este caso la administración del conducto conductor podría reclutar eficazmente marcadores Nestin y MAP2 y, en consecuencia, inducir la diferenciación de las células PC12. El efecto significativo del nanocompuesto de PAG en el conducto de conducción nerviosa sobre el crecimiento, adhesión y diferenciación de las células PC12 es evidencia de la extraordinaria capacidad de los nanocompuestos de PAG sobre la conducción nerviosa y puede ser una opción favorable para la reparación y renovación del sistema nervioso en el tejido. ingeniería.

Volviendo a la hipótesis planteada al comienzo de este estudio, ahora es posible afirmar que la estructura núcleo/cubierta del conducto PCN2 con conductividad eléctrica y propiedad piezoeléctrica tiene una alta potencia para la reparación y regeneración de nervios. El hallazgo más obvio que surge de este estudio es que el conducto PCN2 tiene la capacidad de inducir la diferenciación celular y la reconstrucción nerviosa. Este estudio ha contribuido en cierta medida a comprender el papel y la contribución del conducto que contiene PAG en el proceso de regeneración nerviosa. Sin embargo, se necesita más investigación para comprender mejor la función y el resultado clínico del conducto PCN2.

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Descargar referencias

Departamento de Ingeniería Biomédica, Rama de Ciencia e Investigación, Universidad Islámica de Azad, Teherán, Irán

Hamideh Javidi y Najmeh Najmoddin

Departamento de Ingeniería Química y Petrolera, Universidad Tecnológica de Sharif, Teherán, Irán

Ahmad Ramazani Saadatabadi

Departamento de Ciencia e Ingeniería de Materiales, Universidad Tecnológica de Sharif, Teherán, Irán

SK Sadrnezhaad

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HJ: Metodología, Investigación, Recursos y Software, Redacción-Borrador original. ARSA: Supervisión, Conceptualización, Revisión y Edición. SKS: Supervisión, Revisión y Edición. NN: Interpretación de datos, Revisión y Edición.

Correspondencia a Ahmad Ramazani Saadatabadi o Najmeh Najmoddin.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Javidi, H., Ramazani Saadatabadi, A., Sadrnezhaad, SK et al. Conducto nervioso conductor con propiedades piezoeléctricas para una mejor diferenciación de PC12. Informe científico 13, 12004 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38456-4

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Recibido: 28 de enero de 2023

Aceptado: 08 de julio de 2023

Publicado: 25 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38456-4

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